L’evoluzione della PGD per Traslocazioni Cromosomiche: l’analisi dell’intero assetto cromosomico dell’embrione mediante la tecnica dell’Array-CGH

Recentemente è stata proposta una tecnica innovativa che consente la valutazione dell’intero assetto cromosomico dell’embrione mediante la tecnica dell’ibridazione genomica comparativa su microarray (Array - Comparative Genomic Hybridization o Array-CGH). Tale procedura permette di identificare anomalie cromosomiche di tipo numerico (aneuploidie) a carico dei 22 autosomi (cromosomi dal nr. 1 al nr. 22) e dei cromosomi sessuali (X e Y), o anche variazioni del contenuto di piccole porzioni cromosomiche, come amplificazioni (duplicazioni), delezioni e traslocazioni sbilanciate.

Il principio su cui si basa la tecnica dell’Array CGH è la coibridazione del DNA in esame o DNA test (estratto dalle cellule embrionali) e del DNA genomico di riferimento proveniente da un soggetto sano (reference DNA), marcati in maniera differenziale con molecole fluorescenti, su un microarray di cloni genomici. Il microarray è costituito da un supporto solido, su cui vengono disposti (spottati) una serie di cloni (oltre 5000) corrispondenti a piccole porzione di ciascun cromosoma, fino a ricomprendere l’intero assetto cromosomico umano, raggiungendo una risoluzione di circa 600 Kb.

A seguito di questa co-ibridazione sia il DNA in esame che quello di controllo si legheranno ai cloni presenti su ciascun singolo spot. Il risultato della co-ibridazione sarà l’emissione di due distinti segnali fluorescenti che, a seguito di lettura degli arrays mediante un apposito scanner, forniranno l’immagine su cui verrà poi effettuata l’elaborazione dei dati.
In caso di assetto cromosomico normale, il rapporto tra le due emissioni è bilanciato (1:1). Qualora vi siano nel DNA in esame (embrionale) delle delezioni (assenza di un cromosoma o parte di esso), il rapporto tra quest’ultimo ed il DNA di controllo sarà di 1:2 (monosomia completa o parziale). Nel caso di duplicazioni (presenza di un cromosoma soprannumerario o parte di esso) il rapporto tra il DNA embrionale e quello di controllo sarà di 2:1 (trisomia completa o parziale).
 
Per l’esecuzione della PGD per Traslocazioni Cromosomiche mediante tecnica array-CGH sono previste le seguenti fasi:

 

 

Nella diagnosi preimpianto mediante l’analisi dell’intero assetto cromosomico dell’embrione, la biopsia viene effettuata allo stadio di blastocisti. Ciò consente di prelevare un numero maggiore di cellule embrionali (circa 5 o 10) e quindi ovviare al problema del mosaicismo esistente nell’analisi dell’embrione allo stadio di clivaggio (day 3). 

Una volta introdotti i singoli blastomeri all’interno delle provette analitiche, si aggiunge una soluzione che consente la lisi delle cellule, e quindi la liberazione del DNA dal nucleo cellulare. Successivamente, mediante una reazione di amplificazione enzimatica in vitro, conosciuta come Whole Genome Amplification (WGA), si amplifica milioni di volte il DNA embrionale. Dopo la reazione di amplificazione enzimatica, il prodotto di amplificazione viene quindi sottoposto ad analisi dell’intero assetto cromosomico mediante tecnica dell’Array-CGH. L’intera procedura viene solitamente completata entro 24 ore dalla biopsia, quindi in tempo utile per effettuare il transfer degli embrioni a fresco.  Il transfer degli embrioni, dunque, verrà effettuato  su ciclo a fresco.